Préface juridique: toute ressemblance avec des séquences de personnes vivantes ou parties est purement fortuite. D'ailleurs j'ai caché les noms pour préserver votre anonymat.

Pour les signaux, les infos sont consultables à des endroits variables selon le logiciel d'analyse. Cherchez ...

    Ceux-ci se séquencent bien d'habitude. Il est fortement conseillé de purifier et de doser les produits PCR. Souvent ça marche mieux avec une amorce interne plutôt qu'avec une des amorces PCR. Il faut bien doser les quantités et bien appliquer la règle de trois dans le calcul de la quantité. Ne pas hésiter à mettre très peu d'ADN pour de petits fragments. Les séquences se terminent par un grand pic "A". S'il y a des restes de la séquence analysée juste avant, on voit parfois de petits pics correspondant à celle-ci après la fin du fragment PCR.

    La séquence commence avec des pics au plafond, mais le signal baisse très vite. Ça vient d'un mauvais rapport amorce/matrice, en général parce qu'on a mis trop d'ADN, mais il peut y avoir un problème de quantité d'amorce.

    Ça peut ressembler à "pas assez de matrice" mais les signaux sont TRÈS forts (plusieurs milliers). Le phénomène se manifeste d'abord par des "pics sous les pics" et dans les cas extrêmes, par des pics écrasés. Redoser, recommencer.

    Il y a en fait deux cas de figure. Si on voit les traces de deux séquences dès le début, c'est en général un problème d'amorce. Sur les produits PCR séquencés directement, il ne faut pas qu'il reste des traces des deux amorces utilisées pour l'amplification. Sinon, ça peut marcher (à peu près):



Comme ça peut donner ça:



Autrement, ça vient de la présence de deux sites d'amorçage sur la matrice. C'est un problème surtout sur les grandes matrices.

Dans l'exemple donné ici, c'est un problème de mélange de clones. La séquence se lit parfaitement tant qu'on est dans le vecteur, mais on voit deux traces dès qu'on passe le site de clonage. Ceci semble être un problème avec certains clones pGEM-T, peut-être quand il y a trop de produit PCR dans la ligation.

    La contamination des preps par d'autres molécules, notamment par l'ADN génomique de coli, provoque une migration en "vagues". Une seule solution: recommencer la prep.

    D'autres problèmes sont connus, mais je n'ai pas d'images pour l'instant. Des séquences dont la qualité se dégrade rapidement sont souvent dues à une mauvaise qualité de matrice (contamination par des sels ou autre chose). Les suites d'un même nucléotide peuvent poser un problème pour la polymérase, qui patine dessus et qui en sort totalement décalée. Ceci se traduit souvent par des vagues de couleur sans séquence interprétable. Le cas type est le poly-A des ADNc (vu comme poly-T dans les séquences). D'autres séquences peuvent poser problème, comme des séquences riches en GC, particulièrement quand celles-ci peuvent former des structures secondaires. Le résultat est une séquence parfaitement normale mais qui s'arrête brusquement ou qui continue avec des signaux nettement plus faibles.

    Finalement, le séquençage est une suite très longue de manipulations. Il peut y avoir un problème lors de la préparation de la réaction, de la récupération, de la précipitation, de remplissage de capillaires, de migration dans le capillaire. Une seule solution si vous êtes sûr que votre prep est bonne: recommencer le séquençage.


Et si, avec tout ça, ça ne marche toujours pas, il ne reste plus qu'à partir très loin, en Chine ou à Arcachon.